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技術(shù)文章

如何對(duì)付使用抗體遇到的問(wèn)題點(diǎn)擊次數(shù):1323 更新時(shí)間:2011-05-13

 

  不得不承認(rèn),這里的問(wèn)題都是因?yàn)?strong>流式抗體才引申出來(lái)的,之前的時(shí)候只是了解流式抗體,擁有什么樣的特性、如何的使用等等的一些問(wèn)題那么如何解決使用抗體過(guò)程遇到的問(wèn)題呢?

  比如說(shuō),*、如何選擇合適的一抗?

 

  請(qǐng)先確定您要檢測(cè)的種屬和使用的實(shí)驗(yàn)方法,然后查找相關(guān)產(chǎn)品,根據(jù)說(shuō)明書上描述的適用種屬和實(shí)驗(yàn)方法來(lái)確定合適的抗體。如果說(shuō)明書中有明確您要檢測(cè)的種屬和實(shí)驗(yàn)方法均經(jīng)過(guò)檢測(cè),則您可以放心地購(gòu)買該產(chǎn)品。

  第二、如何選擇合適的二抗?

 

  二抗的選擇原則:

 

  針對(duì)一抗Ig亞型的(比如一抗是IgM,二抗就要是抗IgM的抗體)

  針對(duì)一抗來(lái)源的二抗(比如一抗是小鼠來(lái)源的,二抗就要是抗小鼠的)

  為了增加特異性、降低背景:可以選擇Fab段的抗體(去除Fc段的)、經(jīng)過(guò)標(biāo)本來(lái)源種屬血清吸附的的二抗

  查看二抗的說(shuō)明書,選擇經(jīng)過(guò)驗(yàn)證可以用于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法的二抗

  

  第三、如何確定一抗的稀釋比例?

 

  如果說(shuō)明書中有推薦的稀釋比例,請(qǐng)按照該稀釋比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。但是由于標(biāo)本類型、實(shí)驗(yàn)條件、操作環(huán)境等各種因素的影響,推薦濃度僅作為參考。實(shí)驗(yàn)者需要在推薦濃度周圍進(jìn)行多個(gè)濃度梯度的實(shí)驗(yàn),從中發(fā)現(xiàn)*的稀釋比例。

  

  如果說(shuō)明書沒有推薦稀釋比例,僅注明“Useatanassaydependentdilution”,就需要做大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)摸索*的比例了。下表列出的純化抗體抗體用于不同實(shí)驗(yàn)方法時(shí)常用的工作濃度,可以作為預(yù)實(shí)驗(yàn)的參考。未純化的抗體一般在說(shuō)明書中不會(huì)標(biāo)明抗體的濃度,因?yàn)榇蟛糠秩寡濉⑴囵B(yǎng)上清或腹水形式的產(chǎn)品濃度都是沒有經(jīng)過(guò)測(cè)定的。如果未純化抗體產(chǎn)品的說(shuō)明書中沒有標(biāo)明其中特異性抗體的濃度,實(shí)驗(yàn)者可以參考下表中估計(jì)濃度確定各種實(shí)驗(yàn)稀釋比例。

  

  第四、如何選擇同型對(duì)照?

 

  同型對(duì)照的主要目的是確定一抗的結(jié)合是特異性的,而不是非特異性的Fc受體或與其他蛋白的相互作用。同型對(duì)照要與一抗的來(lái)源、Ig分型和標(biāo)記*一致。例如:一抗是FITC標(biāo)記,其抗體分型是小鼠的IgG1,則同型對(duì)照要選擇是FITC標(biāo)記的小鼠的IgG1。這里如同使用流式抗體一樣,同樣的不可離開說(shuō)明書!

  

  多抗的同型對(duì)照:

 

  絕大部分的同型對(duì)照產(chǎn)品都是單克隆抗體,因此不適用于作為多克隆抗體的對(duì)照(因?yàn)槎嗫购卸喾NIgG的亞型)。

  第五、如何選擇陽(yáng)性對(duì)照?

 

  陽(yáng)性對(duì)照的使用是一個(gè)實(shí)驗(yàn)中確定抗體及檢測(cè)系統(tǒng)是否正常工作的依據(jù),也是確定待測(cè)標(biāo)本中是否存在待測(cè)蛋白的一個(gè)依據(jù)!尤其是檢測(cè)的標(biāo)本是不確定是否有待測(cè)蛋白表達(dá)時(shí)。因此當(dāng)實(shí)驗(yàn)沒有陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)時(shí),的選擇是實(shí)驗(yàn)合適的陽(yáng)性對(duì)照。

  

  說(shuō)明書上都有推薦的陽(yáng)性對(duì)照。但是如果說(shuō)明書上沒有推薦時(shí),請(qǐng)參考以下條款:

 

  看看說(shuō)明書中是否有Abreviews。任何被其他客戶成功檢測(cè)的組織、細(xì)胞或者裂解物均可以作為合適的陽(yáng)性對(duì)照!

  根據(jù)說(shuō)明書上的Swiss-ProtOmnigene數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)查找。這些數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)常會(huì)列出該蛋白表達(dá)的組織,這也可以作為合適的陽(yáng)性對(duì)照!

  查查該蛋白的GeneCards吧,這里通常會(huì)有蛋白在不同組織的表達(dá)水平。

 

  對(duì)于不同的問(wèn)題,不同的測(cè)試,相關(guān)性的不同的性能,拿流式抗體來(lái)說(shuō),在使用的過(guò)程中要特別謹(jǐn)說(shuō)明書使用!

  

  

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